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微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因 那对于平时的实验室环境，我们该如何消毒和灭菌呢？   （一）物理消毒法 1、紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。 紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2米的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3小时，期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。 紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。 2、高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。 不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。 3、高温干热消毒：干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。 干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。 烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。 4、过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。 （二）化学消毒：新洁而灭，其0.1％水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。 （三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。 可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。   一、环境中的支原体污染的预防和清除 Mycoplasma OffTM是一款支原体喷雾剂，用于清除工作区域中的支原体。它起效快（10秒钟即起效），安全无毒，对细胞不会产生不良影响，喷洒后，可再用干净纸张擦拭即可。对于工作台以及各种细胞操作的器具表面，均可使用。如果是需要避免沾染液体的电子设备，可使用Mycoplasma OffTM湿巾擦拭。   细胞孵箱、水浴锅等有温水的地方，也容易滋生支原体、细菌等。在循环水中倒入Water ShieldTM（1：200稀释）即可有效地预防滋生，效果可持续1个月左右。   Mycoplasma OffTM对许多细菌、病毒也有预防和杀灭作用。 二、细胞培养中支原体污染的祛除 通常来说，被污染的细胞应该丢弃，以避免成为污染源。但对于珍贵的细胞，可使用Minerva Biolabs公司的Mynox®或Mynox Gold®。以往别的品牌的支原体清除剂，其实只是抑制剂，它们抑制支原体的DNA合成和蛋白合成，但无法杀除。Mynox®是市面上一款具有杀灭作用的清除剂。它提取自枯草杆菌，可与支原体膜特异性结合，破坏膜通透性，导致支原体膨胀破裂而死。使用Mynox®一般在2-3个小时即可完成清除任务。   Mynox Gold®是Mynox®的升级版，它通过四个疗程产生作用。每个疗程即细胞传一代。它除了包括Mynox®，也包含复合抗生素成分。以往别的品牌的支原体清除剂只是针对支原体的抗生素成分，但也容易产生耐药。Mynox Gold®将Mynox®和抗生素结合，即结合了二者的优点，又去除了二者的不足，因为有的细胞对Mynox®的治疗不太适应，而Mynox Gold®要比Mynox®更加温和，对细胞的毒性效应极小，因而更适用于脆弱的不太好养的细胞。 三、细胞培养中支原体污染的预防 Zell ShieldTM直译过来是细胞盾牌，它不仅能杀菌，还可抑制支原体的蛋白和DNA合成，因而能避免支原体的污染。使用时按1：100的比例加到培养基中，即可使用。它是复合抗生素成分，支原体耐药的出现几率很低。   四、细胞培养中支原体污染的监测 可使用MB公司出品的Venor® Gem系列，最常用的是一步法试剂盒（Venor® Gem OneStep），它采用灵敏的PCR方法，能识别常见的至少二十七种支原体。所有试剂均在一管内，为稳定的冻干粉形式，用缓冲液溶解后可直接使用。细胞上清取2l即可完成支原体的筛查。 总之，支原体虽然发生率高，但可放可控。以上仅仅列举的是实验室的情况，对于生物制药企业，如果是病毒液中发现支原体的污染，也可以采用Mynox®进行清除。总之，支原体的检测和预防已成为一项常规操作，这对保障细胞学实验的顺利进行，是非常重要的。